As listérias são bastonetes Gram-positivos, não esporulados, anaeróbios facultativos, e é um patógeno intracelular, que não coram pela coloração do ácido rápido e apresentam flagelos; elas foram classificadas como “Listerella”, e depois modificado para Listeria em 1940.
As listérias se assemelham ao gênero Brochothrix. Ambos os gêneros são catalase-positivos e tendem a estar associados ao outro na natureza, assim como o Lactobacillus. Todos os três gêneros produzem ácido láctico a partir da glicose e de outros açúcares fermentados, mas os lactobacilos são catalase-negativos. Em certo momento as listérias foram colocadas na família Corinebacteriaceae, mas atualmente estão relacionadas à Bacillus, Lactobacillus e Streptococcus. A partir da seqüência de RNA ribossomal 16S, a Listeria está classificada próximo a Brochothrix, e estes dois gêneros, juntamente com Staphylococcus e Kurthia, ocupam uma posição entre o grupo dos Bacillus e dos Lactobacillus/Streptococcus dentro da ramificação Clostridium-Lactobacillus-Bacillus, onde a porcentagem de G+C de todos esses membros é inferior a 50%. Transferências genéticas ocorrem entre Listeria, Bacillus e Streptococcus, e reações imunológicas correm entre Listeria, Stphylococcus e Lactobacillus.
Listeria spp. contêm ácidos teicóico e lipoteicóico, assim como bacilos, estafilococos, estreptococos e lactobacilos, mas diferentemente destes grupos, suas colônias brilham quando visualizadas por luz transmitida obliquamente.
As listérias estão amplamente distribuídas na natureza e podem ser encontradas em vegetação deteriorada, solos, fezes de animais, silagem, esgotos e água. Em geral, podem ocorrer em locais onde bactérias corineformes estão presentes. Sua associação com certos produtos lácteos e silagem é bem conhecida, assim como a associação desses produtos de ácidos lácticos.
Oito espécies estão relacionadas ao gênero Listeria - L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. denitrificans, L.murrayi e L.grayi-, o mesmo tem sofrido constantes alterações taxonômicas. A espécie L. denitrificans foi reclassificada como Jonesia denitrificans e, recentemente as espécies L. grayi e L. murrayi foram agrupadas em uma única espécie, Listeria grayi. A espécie ivanovii, por sua vez, foi subdividida em duas subespécies: L. ivanovii subsp. ivanovii e L. ivanovii subsp. landoniensis. Mas a principal espécie patogênica e de importância para a microbiologia de alimentos é a Listeria monocytogenes.
A Listeria monocytogenes foi descrita pela primeira vez em 1911, desde então ela tem sido apresentada como um patógeno de mais de 50 mamíferos, incluindo humanos, e de aves silvestres, peixes e crustáceos. O primeiro caso de listerose humana, patologia provocada pela presença de Listeria, foi relatado em 1929, mas foi na década de 80 que se tornou um dos mais importantes patógenos veiculados por alimentos, isso devido à eclosão de diversos surtos de listerose humana.
A Listeria monocytogenes é um bacilo Gram-positivo, não formador de esporo, anaeróbio facultativo. E leva o nome de monocytogenes por apresentar atividade produtora de monócitos. Onde as células jovens, quando observadas no microscópio, apresentam-se na forma lisa, assemelhando-se a pequenos difteróides, medindo de 1,0 a 2,0μ por 0,5μ. Após três a cinco dias de incubação, no entanto, apresentam-se como bacilos longos, medindo de 6 a 20μ. O número de células presentes nos alimentos para que ocorra seu crescimento irá depender do tipo de alimento, e as taxas de prevalência podem variar de 105 a 108. Ela é móvel devido a flagelos peritríquios, apresentando movimentação característica chamada de tombamento, que auxilia na sua identificação. Apresenta catalase positiva e oxidase negativa.
Sabe-se que a L. monocytogenes pode ser encontrada em alimentos frescos de origem animal ou vegetal. Em geral, o microrganismo tem sido encontrado em leite cru, queijo mole, carnes frescas e congeladas, frango, frutos do mar, frutas e produtos vegetais. A prevalência em leite e laticínios tem recebido maior atenção devido aos primeiros surtos, que ocorreu na Escócia durante mais de um ano, onde 260 fazendas que continham tanques de leite cru. Onde foram analisadas diversas amostras onde 25 das 160 amostras foram positivas. Dos 5.779 alimentos analisados na Holanda, em 1988, 3,0% foram positivos. Nos EUA, em um período de 39 meses, 7,1% das 1.727 amostras de carne de gado foram positivas para L. monocytogenes.
Em estudos epidemiológicos, são importantes os esquemas de sorotipagem e fagotipagem. O esquema atual de sorotipagem de Listeria baseia-se na identificação de 15 antígenos somáticos (O) e cinco flagelares (H), sendo 16 sorovariedades reconhecidas para as cinco espécies do grupo um: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. ivanovii subsp. ivanovii e L. ivanovii subsp. Landoniensis e L. welshimeri. O grupo dois é composto pela espécies Listeria grayi contém antígenos O e H específicos. Atualmente, existem 27 fagos para tipificação de L. monocytogenes.
Além da sorotipificação, muitos outros métodos têm sido aplicados para a caracterização de espécies e subespécies de L. monocytogenes. Entre os vários métodos, estão a tipificação por bacteriófagos, a tipificação por eletroforese com enzimas multilocus, análise por enzima de restrição, a eletroforese em gel de campo pulsado, fragmentos de restrição de tamanhos polimórficos de DNA e a tipificação ribossomal.
1.1 Crescimento
As necessidades nutricionais das listérias são típicas das bactérias Gram-positivas. Elas crescem bem em meios comuns como BHI, caldo triptona e caldo tripticase-soja. Embora muitas das necessidades nutricionais tenham sido descritas para L. monocytogenes, acredita-se que as demais espécies tenham necessidades similares. Pelo menos quatro vitaminas do complexo B são necessárias- biotina, riboflavina, tiamina e ácido tioctico-, bem como os aminoácidos cisteínas, glutamina, isoleucina e valina. A glicose aumenta o crescimento de todas as espécies, e vários outros carboidratos simples ou complexos são usados. A Listeria ssp. assemelha-se aos enterococos por ser capaz de hidrolisar esculina e crescer na presença de 10 a 40% de bile, 10% de NaCl, 0,025% de acetato de tálio e 0,04% de telurito de potássio, mas, diferentemente dos enterococos, ela não cresce na presença de 0,02% de azida de sódio. Ao contrário da maioria das bactérias Gram-positivas, as listérias crescem em ágar MacConkey. Embora o ferro seja importante para o crescimento in vivo, a L. monocytogenes aparentemente não possui composto ferro-específico, obtendo o que necessita por meio da mobilização de ferro livre reduzido, o qual se liga a receptores de superfície.
1.1.1. Efeito do pH
O pH ótimo para crescimento para o crescimento desta bactéria está entre 6 e 8, ela pode crescer em uma faixa maior, entre 5 e 9. Em meios de cultura, já se verificou seu crescimento em pH 9,5. Ambientes com pH inferior a 4,5 e superior a 9,5 são considerados hostis a L. monocytogenes. Mas existem relatos de crescimento em meio de cultura com pH de 4,4.
Em geral, o pH mínimo de crescimento de uma bactéria varia em função da temperatura de incubação, composição dos nutrientes, atividade da água e presença e quantidade de NaCl e outros sais inibidores.
1.1.2. Efeito de temperatura
L. monocytogenes apresenta crescimento na faixa de 2,5°C a 44°C, embora existam relatos sobre o crescimento a 0°C. Este microrganismo suporta repetidos congelamento e descongelamentos. O tempo de geração a 35ºC varia conforme o meio em que se encontra. Em meio de cultura de ágar tripticase-soja o crescimento de 78 linhagens de L. monocytogenes ocorre dentro de uma faixa de 0,5ºC a3,0ºC.
1.1.3 NaCl
Com relação à concentração de NaCl, contatou-se a sua sobrevivência em 10,5% incubada a 37ºC por 15 dias e 10 dias, respectivamente. Em concentrações de 20%-30% de NaCl, o tempo de sobrevivência foi reduzido para cinco dias. Mas, se a temperatura é reduzida para 4ºC, a bactéria pode sobreviver por mais de 100 dias em concentrações entre 10,5% e 30,5% de NaCl. Existe uma interação do Ph com o NaCl e a temperatura.
Em estudos foram observados crescimentos em pH de 4,66 o tempo para crescimento visível foi de cinco dias a 30ºC,sem adição de NaCl; oito dias, a 30ºC, com 4% de NaCl; e 13 dias, a 30ºC, com 6% de NaCl. Crescimento a 5º ocorreu somente após nove dias em pH 7,0 sem adição de NaCl; com adição de 4% de NaCl, em 15 dias foi observado crescimento; e com 6% de NaCl, foram necessários 28 dias. Os efeitos do pH e do NaCl foram determinados por serem puramente aditivos e, em nenhum momento, sinergéticos.
1.1.4. Efeito de Atividade da água
A atividade de água ótima para que ocorra crescimento é próxima a 0,97. Mas esta bactéria consegue se multiplicar em atividade de água considerada baixa para a multiplicação de patógenos, 0,92. Existem relatos de sobrevivência de L. monocytogenes a 4ºC por pelo menos 132 dias em caldo de tripticase de soja contendo NaCl na concentração de 25,5%, com atividade de água de 0,83 aproximadamente.
1.2. Características da doença.
É no intestino humano o ponto de entrada da L. monocytogenes no organismo, através das células epiteliais do ápice das microvilosidades. Onde se difundem, não só pelo interior desta célula como também de uma célula para outra. Na fase seguinte, são ingeridas por macrófagos, mas isso não significa uma resposta inflamatória significante. Uma vez as células de L. monocytogenes dentro dos macrófagos ficam protegidas dos leucócitos polimorfonucleares.
Estudos demonstraram que cepas virulentas são capazes de multiplicar-se em macrófagos, que são rompidos e produzem septicemia. Com isso o microrganismo pode atingir outras áreas do organismo, podendo envolver o sistema nervoso central, coração e outros locais. Em mulheres grávidas pode haver invasão do feto, aborto dependendo do estagio de gravidez, parto prematuro, nascimento de natimorto ou haver septicemia neonatal. Em recém-nascido quando infectado no momento do parto e os sintomas típicos de listerose são de uma meningite. A sintomatologia tem início de uma a quatro semanas após o nascimento, mas existem relatos de período de quatro dias.
Na fase entérica, a sintomatologia é semelhante de uma gripe, acompanhada de diarréia e febre moderada. Mas alguns casos estes sintomas são inaparentes. Pode ocorrer também estado de duração indefinida.
A ocorrência de bacteremia por L. monocytogenes em adultos não é rara. Febre é o sintoma mais comum, mas alguns pacientes queixam-se de fadiga, mal-estar, podendo haver presença de náusea, vômitos dores e diarréia. A mortalidade entre imunodeprimidos, debilitados e recém-nascidos é de 30%.
O comprometimento do SNC a manifestção dá-se através do aparecimento de meningite, encefalite e de abcessos. A meningite é a manifestação mais comum, ocorre principalmente em recém-nascidos e idosos. Seu desenvolvimento clínico é fulminante, com índice de mortalidade de, aproximadamente, 70%. Outras formas localizadas de listerose são a endocardite e osteomielite, mas são formas rara. O perído de incubação da listerose varia de um dia a algumas semanas, sendo dose infecciosa de L. monocytogenes desconhecida.
1.3. Mecanismo de Patogenecidade
A L. monocytogenes entra no organismo do hospedeiro por via oral, atinge o trato intestinal aderindo e invadindo a mucosa. Em seguida, a célula bacteriana é fagocitada por macrófagos. Após a lise da membrana fagocítica, é liberada no citoplasma da célula do hospedeiro, onde se multiplica rapidamente. Ocorre também a polimerização de filamentos de actina da célula do hospedeiro, formando longas caudas em uma das extremidades da célula bacteriana. Esses filamentos causam o deslocamento da bactéria no citoplasma, permitindo a invasão das células adjacentes, dando início a um novo ciclo de infecção.
Os fatores de virulência tentam explicar o mecanismo de patogenicidade de L. monocytogenes. Temos:
-Listeriolisina O (LLO)- é uma hemolisina produzida pela L. monocytogenes, faz parte da família da citolisinas formadas pela ativação de grupamentos sulfidrilas. Tem a função de mediar à lise dos vacúolos que contêm a células bacterianas, uma vez que as células mutantes não produtoras de listeriolisina são geralmente encontrados no interior destes vacúolos sendo, conseqüentemente, incapazes de se multiplicar intracelularmente.
-Fosfolipases: a L. monocytogenes produz outras duas hemolisinas a fosfatidilinositol-fosfolipase C (PI-PLC) e a fosfatidilcolina fosfolipase C (PC-PLC), que hidrolisam os lipídeos da membrana, causando ruptura da célula.
-p60: todas as cepas de L. monocytogenes sintetizam esta proteína, parece estar associada com a capacidade invasiva da bactéria, uma vez que está envolvida com a fagocitose de L. monocytogenes e mutantes rugosos apresentam uma diminuição na capacidade invasora.
-Interleucina: é uma proteína da membrana, provavelmente envolvida no mecanismo de invasão da célula do hospedeiro.
1.4. Epidemiologia
A L. monocytogenes pode ser encontrada disseminada na natureza. No homem é difícil realizar seu isolamento devido à colonização no trato intestinal. Mas já foi isolada uma grande variedade de animais gado bovino, galinhas, cachorros, lebres, peixes, larvas de insetos, dentre outros.
O primeiro suro de listerose ocorreu na década de 80 no Canadá, onde foram encontrados repolhos tipo coleslaw contaminados por L. monocytogenes. Nos EUA em 1983, ocorreu um surto que envolveu 49 indivíduos, com mortalidade de 29%, o alimento responsável foi o leite pasteurizado. Na Suíça, entre 1983 e 1987 ocorre um surto causado por queijo tipo mole, com 122 casos e 31 mortes.
A L. monocytogenes tem sido isolada em alimentos como leite cru e pasteurizado, queijos, carnes bovinas, suínas, de aves, peixes embutidos, carne moída de diferentes animais, produtos cárneos crus e termoprocessados, além de produtos de origem vegetal, de origem marinha e refeições preparadas. Isolamentos realizados em diversos países incluindo o Brasil.
Em relação à sua presença em leite pasteurizado, estudos estão sendo realizados para esclarecer a termotolerância desta bactéria. Existem duas teorias para elucidar esta questão. A primeira delas relaciona-se ao fenômeno da resposta do choque térmico: quando as células de L. monocytogenes são expostas a temperaturas sub-leteias, entre 44-48ºC, antes de serem submetidas à temperatura final de tratamento, elas apresentam um aumento de resistência térmica. A segunda teoria diz respeito à metodologia empregada para recuperação de microrganismos estressados por processamento térmico. O uso de técnicas anaeróbias para a recuperação destas células leva à recuperação de um número maior de células do que quando recuperadas na presença de oxigênio.
1.5. Medidas de controle
Para evitar a contaminação dos alimentos por L. monocytogenes, é necessárias medidas de controle no local de processamento do alimento. Sabendo que esta bactéria está amplamente distribuída e pode se desenvolver em ampla faixa de temperatura e de pH, além de ser uma das células vegetativas de maior resistência térmica, deve-se prevenir sua entrada na indústria de alimentos. Para tanto, deve-se fazer controle do microrganismo nos pontos de origem da matéria-prima através de medidas que minimizem as chances de contaminação.
Medidas que podem ser tomadas no local de produção:
Limpeza e sanificação dos equipamentos;
Construção de indústrias de maneira a impedir a entrada de animais, poeiras e insetos;
Evitar contato com o produto final com a matéria-prima, evitando, assim a contaminação cruzada;
Apresentação pela indústria de um setor de controle de qualidade que se aplique não somente aos parâmetros de processamento, mas também ao controle do ambiente, inclusive do pessoal.
BIBLIOGRAFIA
FRANCO, Bernadette D. G. de Melo; Microbiologia dos Alimentos. Págs:46, 47 e 48. Atheneu. São Paulo, 2008.
JAY, James M.; Microbiologia de Alimentos. 6ª Edição. Págs 517 a 537. Artmed. Porto Alegre, 2005
Acadêmica: Karen Quevedo
COLORAÇÃO DE GRAM