COLORAÇÃO

Os corantes combinam-se quimicamente com protoplasma bacteriano; se a célula ainda não estiver morta, o próprio processo de coloração irá destruí-la. Por conseguinte, trata-se de um processo drástico, possível de produzir artefatos.
Os corantes comumente utilizados são os sais. Os corantes básicos consistem em um cátion dotado de cor com ânion incolor (por exemplo: azul de metileno + /cloreto -); os corantes ácidos comportam-se de modo inverso (por exemplo: sódio + eosinato-). As células bacterianas são ricas em ácido nucléico, apresentando cargas negativas na forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes básicos de carga positiva. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas e, por conseguinte, podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor.
Os corantes básicos coram uniformemente as células bacterianas, a não ser que o RNA citoplasmático seja inicialmente destruído. Entretanto, podem-se utilizar técnicas especiais de coloração para diferenciar os flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, grânulos, nucleóides e esporos.

A coloração pelo GRAM

Uma importante característica taxonômica das bactérias consiste na sua reposta à coloração pelo método de GRAM. A propriedade da coloração pelo GRAM parece fundamental, visto que a reação está correlacionada com muitas outras propriedades morfológicas em formas filogeneticamente correlatas. Um microrganismo potencialmente Gram-positivo pode aparecer dessa maneira apenas em determinado conjunto de condições ambientais e em uma cultura jovem.
A coloração de GRAM começa com a aplicação de um corante básico, o cristal violeta. A seguir, aplica-se uma solução de iodo; todas as bactérias coram-se em azul nessa etapa do processo. A seguir, as células são tratadas com álcool. As células Gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, permanecendo azuis; as células Gram-negativas são totalmente descoradas pelo álcool. Como etapa final, aplica-se um contra corante (como o corante vermelho safranina), de modo que as células Gram-negativas descoradas adquirem uma cor contrastante; nessa etapa, as células Gram-positivas exibem uma cor púrpura. A base da reação diferencial de GRAM é a estrutura da parede celular.

Coloração álcool-ácido-resistente

As bactérias álcool-ácido-resistente são as que retêm carbolfucsina (fucsina básica dissolvida em uma mistura de fenol-álcool-água), mesmo quando descoradas com ácido clorídrico em álcool. Um esfregaço de células em lâmina é banhado com carbolfucsinaa e aquecido em vapor. Após esta etapa, procede-se à descoloração com ácido-álcool e por fim aplica-se um contracorante contrastante (azul ou verde). As bactérias álcool-ácido-resistente (micobactérias) e alguns dos actinomicetos relacionados adquirem cor vermelha, enquanto as outras apresentam a cor do contracorante.

Coloração negativa

É um procedimento que envolve a coloração do material de fundo com um corante ácido, deixando as células incolores. O corante negro nigrosina é comumente utilizado. Esse método é empregado para as células ou estruturas difíceis de serem coradas diretamente.

Coloração dos Flagelos

Os flagelos são demasiado finos para serem visíveis ao microscópio óptico. Entretanto, sua presença e distribuição podem ser demonstradas ao tratar as células com uma suspensão coloidal instável de sais de ácido tânico, provocando a formação de um precipitado maciço sobre as paredes celulares e os flagelos. Dessa maneira, o diâmetro aparente dos flagelos aumenta, de modo que a coloração subsequente com fucsina básica irá torná-los visíveis ai microscópio óptico.
Nas bactérias peritríquias, os flagelos formam feixes durante o movimento, podendo ser espessos o suficiente para serem observadas em células vivas à microscopia de campo escuro ou de contraste de fase.

Coloração da cápsula

Em geral, as cápsulas são evidenciadas pelo processo de coloração negativa ou por modificações dela. Um desses “corantes de cápsula” (método de Welch) envolve o tratamento com solução a quente de cristal violeta, seguido de lavagem com solução de sulfato de cobre, utilizada para remover o excesso do corante, pois a lavagem convencional com água dissolveria a cápsula. O sal de cobre também cora o fundo, resultando em uma célula e fundo de cor azul- escura, enquanto a cápsula aparece em azul bem mais claro.

Coloração dos nucleóides

Os nucleóides podem ser corados pelo corante de Feulgen, específicos do DNA.

Coloração dos esporos

Os esporos são observados mais simplesmente na forma de corpúsculos intracelulares refrateis em suspensões de células não coradas ou como áreas incolores em células coradas por métodos convencionais. A parede do esporo é relativamente impermeável, porém os corantes podem atravessá-la mediante o aquecimento da preparação. A seguir, a mesma impermeabilidade serve para evitar a descoloração do esporo pelo tratamento com álcool, suficiente para descorar as células vegetativas, que podem ser finalmente contracoradas. Comumente, os esporos são corados com verde de malaquita ou carbolfucsina.

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 40,41. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: Karen Quevedo