MÉTODOS ÓPTICOS

1. MICROSCÓPIO DE CAMPO LUMINOSO (MICROSCÓPIO ÓPTICO COMUM)
O microscópio de campo luminoso é mais o empregado em microbiologia de rotina, constituindo em duas séries de lentes (objetiva e ocular), que funcionam em conjunto na resolução de imagens. Estes microscópios geralmente empregam uma objetiva com o poder de aumento de 100 vezes, com uma ocular de aumento de 10 vezes, aumentando a amostra 1.00 vezes. Por conseguinte, as partículas com 0,2 μm de diâmetro são ampliadas até cerca de 0,2 mm, tornando-se nitidamente visíveis. A ampliação adicional não proporciona maior resolução doa detalhe, reduzindo a área visível (campo).
Com este microscópio, as amostras são visualizadas devido à diferença de contraste entre elas e o meio ao redor. Muitas bactérias são difíceis de visualizar devido à perda de contraste com o meio. Corantes podem ser usados para corara células ou organelas e aumentar seu contraste de modo a tornar mais fácil a visualização em microscopia de campo luminoso.

2. MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE
O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para aumentar as diferenças de contraste entre células e o meio ao redor, possibilitando ver células vivas sem corá-las; com microscópio de campo luminoso, preparações que coram e matam a célula precisam ser empregadas.
O microscópio de contraste de fase tem como vantagem o fato de que as ondas de luz passam através de objetos transparentes, tais como as células, aparecendo em diferentes fases, dependendo das propriedades dos materiais através dos quais elas passam. Este efeito é ampliado por um anel especial de lentes da objetivas do microscópio de contraste de fase, o que leva à formação de imagem escura em forma de luz de fundo.

3. MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO
O microscópio de campo escuro é um microscópio óptico no qual o sistema de iluminação foi modificado para atingir somente os lados da amostra, o que é obtido pelo uso de um condensador especial que bloqueia tanto os raios da luz direta quanto a luz refletida para o exterior através de um espelho posicionado ao lado do condensador em ângulo oblíquo, criando um “campo escuro” que contrasta contra a borda sombreada das amostras, surgindo quando os raios oblíquos são refletidos a partir das bordas da amostra em direção ascendente à objetiva do microscópio. A resolução obtida por um microscópio de campo escuro é bastante elevada. Assim, essa técnica foi particularmente valiosa na observação de certos organismos, como o Treponema pallidum, um espiroqueta com menos de 0,2 μm de diâmetro e que não pode ser observado em microscópio óptico convencional ou de contraste de fase.

4. MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
O Microscópio de fluorescência é utilizado para visualizar amostras que fluorescem, que é a habilidade de absorver a luz em comprimentos de ondas curtos (ultravioleta) e não brilhar em comprimentos de onda mais longos (luz visível). Alguns organismos fluorescem naturalmente devido à presença de substancias fluorescentes, chamadas de fluorocromos. O microscópio de fluorescência é amplamente utilizado em diagnósticos de microbiologia clínica. Por exemplo, o fluorocromo auramina O, que dá um brilho amarelo quando exposto à luz ultravioleta.
O principal uso da microscopia de fluorescência é na técnica de diagnóstico chamada de imunofluorescência. Nessa técnica, anticorpos específicos (por exemplo: anticorpos contra a Legionella pneumophila) são marcados quimicamente com fluorocromo, como o isotiocianato de fluoresceína. Em seguida, tais anticorpos fluorescentes são adicionados a uma lâmina de microscópio que contém a amostra clínica. Se amostra contém algum L. pneumophila, o anticorpo fluorescente se liga aos antígenos de superfície da bactéria, produzindo fluorescência quando exposto à luz ultravioleta.

5. MICROSCÓPIO DE INTERFERÊNCIA DIFERENCIAL DE CONTRASTE (DIC)
Os microscópios de interferência diferencial de contraste utilizam um polarizador para produzir luz polarizada. Os feixes de luz polarizada passam através de um prisma que vai gerar dois tipos distintos de feixes simples. Devido às ligeiras diferenças do índice de refração das substâncias para cada feixe que passa por elas, os feixes combinados não ficam totalmente na mesma fase; em vez disso, criam um efeito de interferência que intensifica as sutis diferenças na estrutura celular. Estruturas, como esporos, vacúolos e grânulos, aparecem em forma tridimensional. A microscopia da DIC é particularmente útil para a observação das células não coradas devido à sua habilidade de gerar imagens que revelam estruturas celulares internas, menos aparentes pelas técnicas de microscopia óptica.

6. MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
O alto poder de resolução do microscópio eletrônico permitiu aos cientistas a visualização e o detalhamento de estruturas das células procarióticas e eucarióticas. A resolução superior do microscópio eletrônico deve-se ao fato de elétrons terem um comprimento de onda muito mais curto que os fótons de luz branca.
Existem dois tipos de microscópio eletrônico em uso feral: microscópio eletrônico de transmissão (MET) que tem muitas características em comum com o microscópio óptico, e o microscópio eletrônico de varredura (MEV), o primeiro a ser desenvolvido, e que empregada um feixe de elétrons emitido de um canhão e direcionado ou focalizado por um condensador eletromagnético sobre uma amostra delgada. À medida que os elétrons incidem na amostra, são dispersos diferencialmente de acordo com o número e a massa de átomos na amostra; alguns elétrons atravessam a amostra, sendo reunidos e focalizados por uma lente objetiva eletromagnética que fornece uma imagem da amostra a sistema de lentes protetoras para maior ampliação. A imagem é visualizada ao incidir em uma tela que fluoresce com a incidência dos elétrons; pode ser registrada em filme fotográfico. O MET tem uma capacidade de resolução de 0,001 μm para partículas distantes. Os vírus, com diâmetro de 0,01 a 0,2 μm, podem sem facilmente observados.
Em geral, o MEV tem menor poder de resolução do que o MER, mas particularmente útil ao fornecer imagens tridimensionais da superfície dos materiais microscópicos. Os elétrons são focados através de lentes em um ponto muito fino. A interação dos elétrons com a amostra resulta na liberação de diferentes formas de radiação da superfície do material, que podem ser capturadas por um detector apropriado, ampliadas e, a seguir, apresentadas na forma de imagem em microscopia na tela de uma televisão.

7. MICROSCÓPIO DE VARREDURA CONFOCAL A LASER
O microscópio de varredura confocal a laser (MVCL) acopla uma fonte de raio laser à luz do microscópio. Na microscopia de varredura confocal a laser, um feixe de laser é espalhado contra um espelho que o direciona através de um orifício que ajusta precisamente o plano de foco do feixe a uma camada vertical no interior da amostra. Pela iluminação precisa de um único plano da amostra, a intensidade de iluminação cai rapidamente acima e abaixo do plano de foco, e a luz se perde para outros planos de focos, minimizados. Assim, em uma amostra relativamente espessa, varias camadas podem ser observadas ajustando o plano de foco da luz a laser.
Certas células são frequentemente coradas com corantes fluorescentes para torná-las mais visíveis. Alternativamente, imagens com falsas cores podem ser geradas pelo ajuste do microscópio de modo a fazer com que diferentes camadas apresentam diferentes colorações. Os MVCL são equipados com um programa de computador para juntar imagens digitais e processá-las posteriormente. Assim, as imagens obtidas da diferentes camadas podem ser armazenadas e superpostas digitalmente para reconstruir uma imagem tridimensional da amostra inteira.

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 8,9 e 10. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: KAREN QUEVEDO